Étude en collaboration avec
l'Université de Modena et Reggio Emilia

LEVURES POUR VINS EFFERVESCENTS

STRATÉGIES D'ÉVOLUTION ADAPTATIVE ET DE SÉLECTION DE STARTER OPTIMISÉS

Les vins effervescents occupent une place de choix dans l'industrie du vin et leur popularité croissante auprès des consommateurs, de plus en plus attentifs à la qualité des produits, stimule également la recherche sur la sélection de levures optimisées pour la prise de mousse.

La production de vins effervescents et l'utilisation de levures sélectionnées

La production de vin effervescents en bouteilles ou en cuve close est une pratique bien établie, même dans les petits établissements vinicoles. Or, cette pratique, si elle n'est pas effectuée correctement, est à l'origine de plusieurs échecs.

Les effets secondaires les plus courants sont les suivants :

des bouteilles qui explosent en raison d'une pression excessive ;
un vin avec un arrière-goût amer et trop de sédiments ;
un vin qui reste trouble dans la bouteille ;
un vin qui ne refermente pas ;
odeurs de réduction.

Pour surmonter ces problèmes et produire un bon vin effervescent, il est nécessaire de bien comprendre les mécanismes de la fermentation et d'accorder une attention particulière à toutes les étapes de la production, de la vinification des raisins au choix de la méthode de prise de mousse, mais surtout, il faut choisir une souche de levure appropriée.
L'utilisation de levures inadaptées peut compromettre le produit final, en ralentissant ou en bloquant anormalement le processus.

La prise de mousse et les effets indésirables sur les levures

La refermentation, que ce soit en bouteille ou en cuve close, est un processus plutôt contraignant pour les levures, car elles sont soumises à des conditions stressantes telles que :

un pH compris entre 2,8 et 3,5;
une concentration d'éthanol de 11 à 12 % ;
une pression partielle élevée de CO₂(jusqu'à 7-8 atm);
une forte concentration d'acides organiques ;
une concentration élevée de dioxyde de soufre d'environ 50-80 mg/L ;
des températures de fermentation basses, entre 10 et 15 °C.

En outre, le manque d'oxygène empêche la synthèse des stérols et des acides gras insaturés, ce qui altère la fonctionnalité de la membrane cellulaire de la levure.
Des preuves scientifiques confirment les effets indésirables sur les levures, en termes de réduction de l'activité et de la vigueur de la fermentation, dus à l'accumulation de CO₂au cours du processus.

Les acides organiques faibles et leur influence sur le métabolisme cellulaire

Pour mieux comprendre ces effets, il faut considérer l'action des acides organiques faibles, qui influencent le métabolisme de la cellule de manière similaire au dioxyde de carbone.
En fait, le CO₂, même en faible concentration, forme de l'acide carbonique, c'est-à-dire un acide faible. Si l'on évalue les constantes de dissociation de l'acide carbonique et d'autres acides organiques faibles, on constate qu'elles ont des valeurs à peu près similaires, de sorte que l'état de dissociation de ces molécules dans les matrices intra- et extracellulaires sera raisonnablement similaire.
Les acides organiques faibles, à un pH d'environ 3-3,5, se trouvent sous la forme indissociée XCOOH, dans cet état ils sont capables de pénétrer librement à l'intérieur de la cellule où le pH est de 7,4. À cette valeur, ils se dissocient en anion carboxyle XCOOH^-et en ion H⁺. Les anions carboxyles sont incapables de quitter passivement la membrane et s'accumulent dans le cytoplasme. Cette accumulation induit diverses réponses cellulaires au stress et, si elle n'est pas contrôlée, peut même provoquer l'apoptose.

Stratégies d'évolution adaptative pour la sélection des levures

Il s'ensuit qu'une sélection potentielle de cultures de levures adaptées à l'élaboration de vins mousseux peut être réalisée grâce à des stratégies d'évolution adaptative, en utilisant des acides organiques faibles, tels que différentes concentrations d'acide acétique, d'acide sorbique ou d'acide benzoïque, comme facteur de stress. En général, les approches basées sur les principes de l'évolution sont très efficaces pour obtenir des souches présentant des phénotypes spécifiques requis par l'industrie. La clé de l'approche de l'adaptation évolutive est la variabilité génétique générée par les processus de recombinaison, qui augmentent la probabilité de sélectionner des souches améliorées pour les caractéristiques d'intérêt.

En particulier, les processus de recombinaison méiotique sont particulièrement efficaces dans le cas de souches hétérozygotes, puisque le brassage des gènes permet d'obtenir un ensemble différent de cellules haploïdes. En pratique, le crossing over est exploité comme une source de nouvelle variabilité génétique. Cette approche peut également être appliquée dans les programmes de sélection pour obtenir des hybrides intra- et interspécifiques.

La nouvelle souche de levure obtenue par croisement interspecifique

L'approche évolutionniste peut également être appliquée dans les programmes de sélection pour obtenir des breeding intra et interspécifiques. Dans un premier travail réalisé par le groupe de recherche de l'Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), l'approche évolutive, précédemment décrite, a permis d'obtenir une nouvelle souche de Saccharomyces cerevisiae, déposée avec le code UMCC 2949, ayant des caractéristiques phénotypiques d'intérêt telles que la résistance aux acides organiques faibles.
Afin de valider l'hypothèse expérimentale de la correspondance avec la résistance même à des concentrations élevées de CO₂, des tests ont été effectués en cuves closes, et la souche sélectionnée s'est bien comportée.
Afin d'améliorer encore la souche UMCC 2949, en lui donnant également une plus grande résistance aux basses températures, la stratégie de sélection interspécifique a ensuite été appliquée, en croisant la souche S. cerevisiae avec la souche UMCC 2633 de l'espèce S. uvarum. Les colonies résultant des différents croisements entre les spores des deux souches parentales ont été caractérisées au niveau moléculaire, au moyen d'une analyse des colonies et d'une analyse RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de la région ITs-5,8s de l'ARNr, afin de confirmer la formation des hybrides (voir la figure 1 ci-dessous).

Figura 1

Représentation schématique de la stratégie de reproduction interspécifique :

a) croisement direct spore-spore entre des souches de S. cerevisiae et S. uvarum ;

b) caractérisation moléculaire des cultures issues des croisements ;

c) le dépistage phénotypique ;

d) des essais de fermentation pour évaluer la performance des hybrides.

La performance fermentaire de la nouvelle levure

Par la suite, l'hybride sélectionné, nommé UMCC 3008, a été testé sur des milieux sélectifs pour la tolérance à l'éthanol à 12% et 15%, dans deux conditions de température différentes, 15 et 27 °C respectivement, et la résistance à l'acide acétique à des concentrations de 50 mM et 75 mM. La performance fermentaire de l'hybride UMCC 3008 a été évaluée de façon préliminaire lors de tests de microvinification effectués dans des flacons Erlenmeyer avec du vin de base additionné de saccharose à une concentration finale de 30 g/l. Enfin, un test a été effectué sur le milieu de croissance BIGGY agar pour une estimation qualitative de la production de sulfure d'hydrogène.

RÉSULTATS DE LA RECHERCHE

Le criblage phénotypique a montré les résultats suivants pour le nouvel hybride UMCC 3008 et la souche UMCC2949 (voir le tableau 1 ci-dessous) :

tolérance à l'éthanol dans les conditions testées ;
résistance à des concentrations d'acide acétique allant jusqu'à 50 mM ;
faible production de H₂S ;
une bonne tolérance aux pressions sélectives appliquées lors du criblage phénotypique ;
excellente aptitude fermentaire dans les tests de microvinification.

Par conséquent, on considère que cet hybride et son parent sont d'excellents candidats comme cultures starter à valider par des expérimentations supplémentaires afin de confirmer leur performance fermentaire et leur aptitude à la production de vins effervescents.

Cod. UMCC	Espèce	Éthanol 12%		Éthanol 15%		Acide acétique 50 mM	Acide acétique 75 mM	H₂S (Biggy agar)
		15°	27°	15°	27°	27°	27°	27°
UMCC 2949	*S. cerevisiae*	+	+	+	+	+	+	moyen
UMCC 2633	*S. uvarum*	+	+	-	-	+	-	faible
UMCC 3008	*S. cerevisiae x S. uvarum*	+	+	+	+	+	-	faible

Tableau 1
Dépistage de la résistance à l'éthanol, effectué sur milieu YPDA avec ajout de 12% ou 15% d'éthanol (incubation à 15°C et 27°C) et à l'acide acétique, effectué sur milieu minimal Yeast Nitrogen Base (YNB) avec ajout d'acide acétique 50mM ou 75mM, plus évaluation qualitative de la production de H2S sur milieu BIGGY agar, après 6 jours d'incubation sur plaque.

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