Studie in Zusammenarbeit mit der
Universität von Modena und Reggio Emilia

HEFEN FÜR SCHAUMWEINE

ADAPTIVE EVOLUTION UND ZÜCHTUNGSSTRATEGIEN ZUR AUSWAHL OPTIMIERTER STARTERHEFEN

Schaumweine nehmen in der Weinindustrie eine herausragende Stellung ein, und ihre wachsende Beliebtheit bei den Verbrauchern, die immer mehr Wert auf die Produktqualität legen, regt auch die Forschung zur Auswahl von Starterweinen an, die für den Schaumweinprozess optimiert sind.

Die herstellung von schaumwein und die verwendung ausgewählter hefen

Die Herstellung von Schaumwein in Flaschen oder im Tank ist eine gängige Praxis, selbst in kleinen Weingütern. Diese Praxis ist jedoch, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, die Ursache für eine Reihe von Misserfolgen.

Zu den häufigsten unerwünschten Wirkungen gehören:

Flaschenexplosion aufgrund von Überdruck;
ein Wein mit einem bitteren Nachgeschmack und zu viel Bodensatz;
ein Wein, der in der Flasche trüb bleibt;
ein Wein, der nicht nachgärt;
Gerüche von Reduktionen.

Um diese Probleme zu überwinden und einen guten Schaumwein herzustellen, ist es notwendig, die Mechanismen der Gärung zu verstehen und allen Phasen der Herstellung, von der Weinbereitung bis zur Wahl der Schaumweinmethode, große Aufmerksamkeit zu schenken.
Die Verwendung ungeeigneter Hefen kann das Endprodukt beeinträchtigen, indem sie den Prozess verlangsamt oder ungewöhnlich blockiert.

Gärung und unerwünschte auswirkungen auf hefen

Die Gärung, sei es in der Flasche oder im Tank, ist für die Hefen ein eher einschränkender Prozess, da sie stressigen Bedingungen ausgesetzt sind, wie z.B.:

ein pH-Wert zwischen 2,8 und 3,5;
eine Ethanolkonzentration von 11% bis 12%;
ein hoher Partialdruck von CO₂ (bis zu 7-8 atm );
eine hohe Konzentration an organischen Säuren;
eine hohe Schwefeldioxidkonzentration von etwa 50-80 mg/L;
niedrige Gärungstemperaturen zwischen 10 und 15 °C.

Darüber hinaus verhindert der Sauerstoffmangel die Synthese von Sterolen und ungesättigten Fettsäuren, was die Funktionalität der Hefezellmembran verändert.
Wissenschaftliche Erkenntnisse bestätigen die unerwünschten Auswirkungen auf die Hefen in Form von verminderter Aktivität und Gärstärke, die auf die Anreicherung von CO₂ während des Prozesses zurückzuführen sind.

Schwache organische säuren und ihr einfluss auf den zellstoffwechsel

Um diese Auswirkungen besser zu verstehen, muss man die Wirkung schwacher organischer Säuren betrachten, die den Stoffwechsel der Zelle in ähnlicher Weise beeinflussen wie Kohlendioxid.
Tatsächlich bildet CO₂ schon in geringen Konzentrationen Kohlensäure, also eine schwache Säure. Wenn man die Säuredissoziationskonstanten von Kohlensäure und anderen schwachen organischen Säuren auswertet, stellt man fest, dass sie in etwa ähnliche Werte haben, so dass der dissoziative Zustand dieser Moleküle in intra- und extrazellulären Matrices einigermaßen ähnlich sein wird.
Schwache organische Säuren liegen bei einem pH-Wert von etwa 3-3,5 in der indissoziierten Form XCOOH vor. In diesem Zustand können sie frei in das Innere der Zelle gelangen, wo der pH-Wert 7,4 beträgt. Bei diesem Wert dissoziieren sie in das Carboxylanion XCOOH^-und das H₊ Ion. Die Carboxylanionen sind nicht in der Lage, die Membran passiv zu verlassen und reichern sich im Zytoplasma an. Diese Anhäufung löst verschiedene zelluläre Reaktionen auf Stress aus und kann, wenn sie unkontrolliert bleibt, sogar die Apoptose einleiten.

Adaptive evolutionsstrategien für die hefeselektion

Daraus folgt, dass eine potenzielle Selektion von Hefekulturen, die für die Schaumweinherstellung geeignet sind, mit adaptiven Evolutionsstrategien erreicht werden kann, wobei schwache organische Säuren, wie verschiedene Konzentrationen von Essigsäure, Sorbinsäure oder Benzoesäure, als Stressfaktor eingesetzt werden. Im Allgemeinen sind Ansätze, die auf evolutionären Prinzipien beruhen, sehr effektiv bei der Gewinnung von Stämmen mit spezifischen Phänotypen, die in der Industrie benötigt werden. Der Schlüssel zum Ansatz der evolutionären Anpassung ist die genetische Variabilität, die durch Rekombinationsprozesse erzeugt wird, die die Wahrscheinlichkeit der Selektion verbesserter Stämme für die gewünschten Eigenschaften erhöhen.

Insbesondere meiotische Rekombinationsprozesse sind bei heterozygoten Stämmen besonders wirksam, da die Umverteilung von Genen es ermöglicht, einen anderen Satz haploider Zellen zu erhalten. In der Praxis wird die Kreuzung als Quelle für neue genetische Variabilität genutzt. Dieser Ansatz kann auch in Zuchtprogrammen angewandt werden, um sowohl intra- als auch interspezifische Hybride zu erhalten.

Der neue hefestamm, der durch interspezifische züchtung gewonnen wurde

Der evolutionäre Ansatz kann auch in Zuchtprogrammen angewandt werden, um sowohl intra- als auch interspezifische Hybride zu erhalten. In einer ersten Arbeit, die von der Forschungsgruppe der Unimore Microbial Culture Collection (UMCC) durchgeführt wurde, ermöglichte der zuvor beschriebene evolutionäre Ansatz die Gewinnung eines neuen Stammes von Saccharomyces cerevisiae, der unter dem Code UMCC 2949 hinterlegt wurde und die gewünschten phänotypischen Merkmale wie die Resistenz gegen schwache organische Säuren aufweist.
Um die experimentelle Hypothese der Übereinstimmung mit der Resistenz auch bei hohen CO₂-Konzentrationen zu bestätigen, wurden Sekttests in Prototyptanks durchgeführt, bei denen der ausgewählte Stamm gut abschnitt.
Um den Stamm UMCC 2949 weiter zu verbessern und ihn auch gegen niedrige Temperaturen widerstandsfähiger zu machen, wurde anschließend die interspezifische Zuchtstrategie angewandt, indem der Stamm S. cerevisiae mit dem Stamm UMCC 2633 der Spezies S. uvarum gekreuzt wurde. Die aus den verschiedenen Kreuzungen zwischen den Sporen der beiden Elternstämme hervorgegangenen Kolonien wurden auf molekularer Ebene mittels "Kolonie-PCR" und RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism) der ITs-5,8s-Region der rNA charakterisiert, um die Bildung der Hybriden zu bestätigen (siehe Abbildung 1 unten).

Abbildung 1

Schematische Darstellung der interspezifischen Züchtungsstrategie:

a) direkte Sporen-Sporen-Kreuzung zwischen S. cerevisiae und S. uvarum-Stämmen;

b) molekulare Charakterisierung der aus den Kreuzungen hervorgegangenen Kulturen;

c) phänotypisches Screening;

d) Fermentationsversuche zur Bewertung der Leistungsfähigkeit der Hybride.

Die fermentationsleistung der neuen hefe

Anschließend wurden die ausgewählte Hybride mit der Bezeichnung UMCC 3008 selektiv auf ihre Toleranz gegenüber 12 % und 15 % Ethanol unter zwei verschiedenen Temperaturbedingungen (15 bzw. 27 °C) sowie auf ihre Resistenz gegenüber Essigsäure in Konzentrationen von 50 mM und 75 mM getestet. Die Gärungsleistung des Hybrids UMCC 3008 wurde vorab in Mikrovinifikationstests in Flaschen mit Saccharose-angereichertem Grundwein in einer Endkonzentration von 30 g/l bewertet. Schließlich wurde ein BIGGY-Agar-Wachstumsmediumtest durchgeführt, um eine qualitative Einschätzung der Schwefelwasserstoffproduktion vorzunehmen.

FORSCHUNGSERGEBNISSE

Das phänotypische Screening ergab die folgenden Ergebnisse für die neue Hybride UMCC 3008 und den Stamm UMCC2949 (siehe Tabelle 1 unten):

Toleranz gegenüber Ethanol unter den getesteten Bedingungen;
Resistenz gegenüber Essigsäurekonzentrationen von bis zu 50 mM;
geringe H₂S-Produktion;
gute Toleranz gegenüber dem im phänotypischen Screening angewandten Selektionsdruck;
ausgezeichnete Fermentationsfähigkeit in Mikrovinifikationsversuchen.

Daher wird davon ausgegangen, dass diese Hybride und ihr Vorfahre ein hervorragender Kandidat für Starterkulturen sind, die durch weitere Versuche validiert werden müssen, um ihre Gärungsleistung und ihre Eignung für die Herstellung von Schaumweinen zu bestätigen.

Cod. UMCC	Species	Ethanol 12%		Ethanol 15%		Acetic acid 50 mM	Acetic acid 75 mM	H₂S (Biggy agar)
		15°	27°	15°	27°	27°	27°	27°
UMCC 2949	*S. cerevisiae*	+	+	+	+	+	+	medium
UMCC 2633	*S. uvarum*	+	+	-	-	+	-	low
UMCC 3008	*S. cerevisiae x S. uvarum*	+	+	+	+	+	-	low

Tabelle 1
Screening auf Resistenz gegen Ethanol, durchgeführt auf YPDA-Medium mit 12% oder 15% Ethanolzusatz (Inkubation bei 15°C und 27°C) und Essigsäure, durchgeführt auf Yeast Nitrogen Base (YNB) Minimalmedium mit 50mM oder 75mM Essigsäurezusatz, zusätzlich qualitative Bewertung der H2S-Produktion auf BIGGY-Agar-Medium, nach 6 Tagen Platteninkubation.

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Unsere önologischen Hefen werden mit dem Ziel hergestellt, den vielfältigen Anforderungen der Weinbereitung gerecht zu werden. Unsere Wein- und Sekthefen werden aufgrund von technologischen Besonderheiten ausgewählt, die von Önologen geschätzt werden, wie z.B. eine hohe Gärstärke und Schwefeldioxidresistenz. Darüber hinaus verstärken sie die Aromen der Trauben und sorgen für eine gleichmäßige Gärung aller Weine, von Rosé- über Rot- und Weißweinen bis hin zu Schaumweinen und Bioweinen.

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