Estudo em colaboração com a
Universidade de Modena e Reggio Emilia

LEVEDURAS PARA VINHOS ESPUMANTES

ESTRATÉGIAS DE EVOLUÇÃO ADAPTATIVA E DE BREEDING (REPRODUÇÃO) PARA A SELEÇÃO DE STARTER OTIMIZADOS

Os vinhos espumantes ocupam uma posição muito importante no setor vitivinícola e a sua crescente popularidade junto dos consumidores, cada vez mais atentos à qualidade dos produtos, incentiva também a investigação para a seleção de starter otimizadas para o processo de espumantização.

A produção de vinho espumante e a utilização de leveduras seleccionadas

A produção de vinho espumante em garrafa ou em autoclave é hoje uma prática consolidada inclusive a nível de pequenas adegas. Todavia, esta prática, quando não executada de forma correta, é causa de vários insucessos.

Os efeitos secundários mais comuns incluem:

a explosão das garrafas, por excesso de pressão;
um vinho com retrogosto amargo e com demasiado sedimento;
um vinho que permanece velado em garrafa;
um vinho que não refermenta;
odores a reduzido.

Para corrigir estes problemas e produzir um bom vinho espumante, é preciso conhecer muito bem os mecanismos da fermentação e estar muito atento a todas as fases de produção, desde a vinificação das uvas à escolha do método de espumantização, mas sobretudo é preciso escolher uma adequada cultura starter.
A utilização de leveduras não adequadas pode comprometer o produto final, retardando ou bloqueando o processo, de forma anómala.

A refermentação e os efeitos indesejáveis sobre as leveduras

A refermentação, em garrafa ou em autoclave, é um processo bastante limitante para as leveduras, uma vez que são submetidas a condições estressantes como:

um pH entre 2.8 e 3.5;
uma concentração de etanol de 11% - 12%;
uma elevada pressão parcial de CO₂ (até 7-8 atm);
ma alta concentração de ácidos orgânicos;
uma elevada concentração de anidrido sulfuroso, cerca de 50-80 mg/L;
baixas temperaturas de fermentação, entre os 10 e 15 °C.

Além disso, a falta de oxigênio impede a síntese de esteróis e de ácidos gordos insaturados, alterando a funcionalidade da membrana celular das leveduras.
Evidências científicas confirmam os efeitos indesejáveis sobre as leveduras, em termos de redução da atividade e do vigor fermentativo, devidos ao acúmulo de CO₂ durante o processo.

Ácidos orgânicos fracos e a influência no metabolismo celular

Para melhor entender estes efeitos, é preciso ter em conta a ação dos ácidos orgânicos fracos, os quais têm influência sobre o metabolismo da célula de forma semelhante à do anidrido carbónico.
O CO₂, mesmo em baixas concentrações, forma ácido carbônico, ou seja, um ácido fraco. Se avaliarmos as constantes de dissociação ácida do ácido carbônico e de outros ácidos orgânicos fracos, pode-se observar que eles possuem valores aproximadamente semelhantes; portanto, será razoavelmente semelhante o estado dissociativo destas moléculas nas matrizes intra e extracelulares.
Os ácidos orgânicos fracos têm um valor de pH em torno de 3-3,5. São encontrados na forma não dissociada XCOOH. Neste estado eles são capazes de entrar livremente na célula onde o pH é 7,4. Neste valor, dissociam no anião carboxílico XCOOH^- e H⁺. Os aniões carboxílicos não conseguem sair passivamente da membrana e vão se acumulando dentro do citoplasma. Esse acúmulo induz várias respostas celulares ao estresse e, quando não controlado, pode também induzir à apoptose (morte das células).

As estratégias de evolução adaptativa para a seleção das leveduras

Conclui-se que uma potencial seleção de culturas de leveduras indicadas para a espumantização pode ser obtida com estratégias de evolução adaptativa, utilizando ácidos orgânicos fracos, com diferentes concentrações de ácido acético, ácido sórbico ou ácido benzóico, como fator de estresse. Em geral, as abordagens baseadas em princípios evolutivos são muito eficazes para obter estirpes com fenótipos específicos exigidos no campo industrial. O ponto chave para a abordagem de adaptação evolutiva é a variabilidade genética originada pelos processos de recombinação, que aumentam a probabilidade de seleção das estirpes melhoradas para as características de interesse.

Em especial, os processos de recombinação meiótica resultam particularmente eficazes no caso de estirpes heterozigóticas, uma vez que a remistura dos genes permite obter um conjunto diferente de células haplóides. Na prática, desfruta-se do crossing over como fonte de nova variabilidade genética. Tal abordagem também pode ser aplicada nos programas de breeding para obter híbridos intra ou interespecíficos.

A nova estirpe de levedura obtida por breeding interespecífico

A abordagem evolutiva pode ser aplicada também nos programas de breeding para obter híbridos intra e interespecíficos. Num primeiro trabalho desenvolvido pelo grupo de investigação da Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), a abordagem evolutiva, anteriormente descrita, permitiu obter uma nova estirpe de Saccharomyces cerevisiae, depositada com o código UMCC 2949, tendo como características fenotípicas de interesse, a resistência a ácidos orgânicos fracos.
A fim de validar a hipótese experimental da correspondência com a resistência mesmo a altas concentrações de CO₂, foram realizados ensaios de espumantização em protótipos de autoclave, nos quais a estirpe selecionada resultou performante.
Para posteriormente melhorar a estirpe UMCC 2949, conferindo-lhe também uma maior resistência às baixas temperaturas, foi sucessivamente aplicada a estratégia de breeding interespecífico, cruzando a estirpe S. cerevisiae com a estirpe UMCC 2633 da espécie S. uvarum. As colônias resultantes dos diferentes cruzamentos entre os esporos das duas estirpes parentais foram caracterizadas a nível molecular, por meio de "Colony PCr" e análise RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) da região ITs-5.8s do rNA, a fim de confirmar a formação dos híbridos (ver Figura 1 abaixo).

Figura 1

Esquema representativo da estratégia de breeding interespecífico:

a) cruzamento esporo-esporo direto entre a estirpe de S. cerevisiae e a S. uvarum;

b) caracterização molecular das culturas derivadas dos cruzamentos;

c) screening fenotípicos;

d) ensaio de fermentação para avaliar a performance do híbrido.

Os desempenhos fermentativos da nova levedura

Posteriormente, o híbrido selecionado, denominado UMCC 3008, foi testado em meios seletivos para verificar tolerância ao etanol 12% e 15%, em duas diferentes condições de temperatura, respetivamente 15 e 27°C, e a resistência ao ácido acético nas concentrações de 50 mM e 75 mM. Os desempenhos fermentativos do híbrido UMCC 3008 foram preliminarmente avaliados em ensaios de microvinificação realizados em frascos com vinho base adicionado de sacarose à concentração final de 30 g/L. Por fim, foi realizado um ensaio em meio de crescimento BIGGY agar para uma estimativa qualitativa da produção de ácido sulfídrico.

OS RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO

Os screnning fenotípicos mostraram os seguintes resultados para o novo híbrido UMCC 3008 e a estirpe UMCC2949 (ver Tabela 1 abaixo):

tolerância ao etanol nas condições testadas;
resistência às concentrações de ácido acético até 50mM;
baixa produção de H₂S;
boa tolerância às pressões seletivas aplicadas nos screening fenotípicos;
excelente aptidão fermentativa nos ensaios de microvinificação.

Portanto, considera-se que este híbrido e seu ancestral são excelentes candidatos como culturas starter a serem validadas através de novos ensaios a fim de confirmar as suas performances fermentativas e sua aptidão para a produção de vinhos espumantes.

Código UMCC	Espécie	Etanol 12%		Etanol 15%		Ácido acético 50 mM	Ácido acético 75 mM	H₂S (Biggy agar)
		15°	27°	15°	27°	27°	27°	27°
UMCC 2949	*S. cerevisiae*	+	+	+	+	+	+	média
UMCC 2633	*S. uvarum*	+	+	-	-	+	-	baixa
UMCC 3008	*S. cerevisiae x S. uvarum*	+	+	+	+	+	-	baixa

Tabela 1
Screening de resistência ao etanol, feito em meio YPDA adicionado de 12% ou 15% (incubação a 15°C e 27°C) e ao ácido acético, efetuado em meio mínimo Yeast Nitrogen Base (YNB) adicionado de ácido acético 50mM ou 75mM, além disso, avaliação qualitativa da produção de H₂S em meio agar BIGGY, após 6 dias de inoculação nas placas.

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